Meccanismi di resistenza agli acidi organici in lieviti non Saccaromiceti. Zygosaccharomyces parabailii e Kluyveromyces marxianus come case study

The efficient implementation of biorefinery to produce bio-based chemicals and fuels requires sustainable source of feedstock and robust microbial factories. Among others, lignocellulose and whey represent cheap and sugars-enriched feedstock, which are residual wastes deriving from wood/agriculture and dairy industry. The conversion of lignocellulose and whey into the desired products using microbial cell factories is a promising option to replace the fossil based petrochemical refinery. Different bacteria, algae and yeasts are currently used as microbial hosts, but their number is predicted to increase over next years. Minimum nutritional requirements and robustness have made yeasts a class of microbial hosts widely employed in industrial biotechnology, exploiting their natural abilities as well as genetically acquired pathways for production of natural and recombinant products, among which bulk chemicals such as organic acids. However, an efficient and economically viable production of organic acids has to face problems related to low productivity/titer and toxicity of the final product. Therefore, the exploration of yeast biodiversity to exploit unique native features and the understanding of mechanisms to endure harsh conditions are essential to develop ultra-efficient and robust industrial yeast with novel properties. The aim of the research thesis is to evaluate the mechanism of weak acid stress response in the non-Saccharomyces yeasts Zygosaccharomyces parabailii and Kluyveromyces marxianus. To better understand the weak acid stress response of Z. parabailii, we summarized recent finding on the species. Knowing the relevant scientific reports, next study was focused on the effect of lactic acid stress on Z. parabailii. The study revealed that cells are able to tolerate 40g/l of lactic acid without lag phase of growth and exhibiting a negligible percentage of dead cell. More importantly, during lactic acid exposure we observed structural modifications at the level of cell wall and membrane. These findings confirmed the peculiar ability of Z. parabailii to adapt to the weak acids via remodeling of cellular components. The lack of a complete genome assembly and annotation encouraged us to perform a genome sequencing and genome study of our Z. parabailii strain. The results revealed that Z. parabailii is undergoing fertility restoration after interspecies hybridization event, which may shed a light to the process of whole genome duplication. The availability of Z. parabailii complete genome information allowed us to perform the first RNA-sequencing analysis on the species exposed to lactic acid stress. The results showed upregulation of mitochondrial and oxidative stress genes, and downregulation of a subset of cell wall genes, in addition to other specific regulations related to redox balance and ion homeostasis. Remarkably, several differentially regulated genes differ significantly from the S. cerevisiae counterpart or even seems not to have a homologue. Increased interest of K. marxianus application in industrial biotechnology led us to study its multidrug resistance transporters during acetic and lactic acid stress. The results showed a strain specific response to weak organic acid stress, and a possible involvement of KmPDR12 in acetic and lactic acid stress resistance, opening possibility for future discoveries and novel studies.

Al fine di rendere efficiente la produzione di biomolecole e biocarburanti tramite le bioraffinerie, è necessario avere a disposizione materie prime rinnovabili e cell factory microbiche robuste. Fra le diverse opzioni, la lignocellulosa e il siero di latte, sottoprodotti delle industrie forestali, agricole e casearie, rappresentano materie prime economiche e ricche di zuccheri. La conversione della lignocellulosa e del siero di latte nei prodotti desiderati tramite cell factory microbiche è un’opzione interessante per la sostituzione delle raffinerie petrolchimiche. Diversi batteri, alghe e lieviti sono già utilizzati come cell factory, ma è previsto che il loro numero aumenti nei prossimi anni. Scarse richieste nutrizionali e robustezza sono caratteristiche che hanno reso i lieviti una classe di microrganismi largamente utilizzata nelle biotecnologie industriali. Ciò è stato possibile grazie allo sfruttamento delle loro qualità naturali e all’ingegnerizzazione di pathway metabolici per la produzione di prodotti naturali o ricombinanti, tra i quali molecole come gli acidi organici. Lo scopo della tesi di ricerca è stato quello di valutare i meccanismi di risposta allo stress indotto da acidi deboli nei lieviti non-Saccaromiceti Zygosaccharomyces parabailii e Kluyveromyces marxianus. Per capire al meglio la risposta nei confronti dello stress indotto da acidi deboli di Z. parabailii, abbiamo ricapitolato tutti le recenti scoperte riguardo questa specie. Una volta venuti a conoscenza delle scoperte scientifiche più rilevanti, ci siamo focalizzati sull’effetto indotto da acido lattico nei confronti del ceppo di Z. parabailii utilizzato nel nostro laboratorio. Lo studio ha rivelato che le cellule sono in grado di sopportare fino a 40g/L di acido lattico senza mostrare una fase lag nelle cinetiche di crescita, ed una percentuale irrisoria di cellule morte. Ma ancor più importante è da sottolineare il fatto che durante l’esposizione all’acido lattico abbiamo osservato modificazioni strutturali a livello della parete e della membrana cellulare. Questi risultati hanno confermato la peculiare abilità di Z. parabailii di adattarsi agli acidi deboli tramite il rimodellamento di alcune componenti cellulari. La mancanza di un genoma di riferimento completo ci ha spinto a compiere il lavoro di sequenziamento, assemblaggio ed annotazione: questo lavoro, oltre a permetterci di evidenziare la natura ibrida del ceppo di Z. parabailii considerato, ha aperto la possibilità di ulteriori studi. I risultati hanno rivelato che Z. parabailii sta subendo un ripristino della fertilità, a seguito dell’evento di ibridazione interspecie, cosa che potrebbe chiarire il processo di duplicazione dell’intero genoma avvenuta in S. cerevisiae ed altri lieviti appartenenti al medesimo clade. Avere a disposizione le informazioni riguardo il genoma completo di Z. parabailii ci ha permesso di portare a termine la prima analisi di sequenziamento dell’RNA sulla specie, quando esposta allo stress da acido lattico. I risultati hanno mostrato l’up-regolazione di geni mitocondriali e connessi allo stress ossidativo, e la down-regolazione di una serie di geni codificanti per determinanti della parete cellulare, in aggiunta alle regolazioni specifiche riguardanti il bilanciamento redox e l’omeostasi di ioni, tra cui il Ferro. È degno di nota il fatto che molti geni sono regolati differentemente rispetto alla controparte di S. cerevisiae, o addirittura non sembrano possedere un omologo nel lievito di riferimento.