Integrated approach to study Ras-dependent cancer metabolic rewiring in mouse fibroblasts

Cancer cells adapt their metabolism to meet the energetic and biosynthetic demands associated to their enhanced growth. Metabolic alterations in cancer are under direct control of oncogenes such as ras, and include the increase in glucose and glutamine consumption, decreased mitochondrial activity and increase in ROS production. Since molecules out of many cascades of interconnected biochemical pathways are involved in oncogenesis, cancer is a Systems Biology disease, requiring the integration of the knowledge derived from experimental results through mathematical models. Here we study the effect of K-ras oncogene activation in NIH3T3 mouse fibroblasts on transport and metabolism of cysteine and methionine, the two proteinogenic sulphur-containing amino acids. While methionine may act as a precursor for cysteine synthesis, cysteine is in turn a precursor for the biosynthesis of antioxidant glutathione. We show that cysteine limitation and deprivation cause apoptotic cell death in both normal and K-ras-transformed fibroblasts (NIH-RAS), due to accumulation of reactive oxygen species and a decrease in reduced glutathione. Only cysteine-containing glutathione partly rescues the cell growth defect induced by limiting cysteine, showing that mouse fibroblasts use cysteine mainly in the synthesis of glutathione and require an exogenous cysteine source for protein synthesis. On the contrary, methionine limitation and deprivation have only a cytostatic effect on mouse fibroblasts, unaffected by glutathione. NIH-RAS cells -but not their parental NIH3T3- are extremely sensitive to methionine limitation. This fragility correlates with decreased expression of the Slc6a15 gene -encoding the nutrient transporter SBAT1, known to exhibit a strong preference for methionine- and decreased methionine uptake. Remarkably, expression of the ortholog human gene SLC6A15 is mostly down-regulated in the NCI-60 human cancer cells. An exception is represented by melanoma cells, in which SLC6A15 is highly up-regulated. Thus, therapeutic regimens of cancer involving modulation of methionine metabolism could be more effective in cells with limited methionine transport capability. We next study glutamine roles in metabolism and redox homeostasis in K-ras-transformed NIH3T3 mouse fibroblasts (NIH-RAS), by complementing glutamine deprivation with dimethyl-α-ketoglutarate (AKG) and nonessential amino acids (NEAA). The combination AKG+NEAA only partly rescues glutamine deprivation and activates mTOR pathway. This substitution results in low levels of nucleotides and the non-use of reductive carboxylation of AKG –predicted by ENGRO model– to synthesize lipids, whose content is lower due to downregulated expression of genes involved in lipogenesis that correlates with lower NADPH levels. Thus, in NIH-RAS cells glutamine is essential as a carbon and nitrogen source for biosynthesis (amino acids, nucleotides and glutathione) and as a signaling molecule. We successfully exploit an integrated, Systems Biology approach to study nutritionally-perturbed transformed cells, pushing forward a system-level understanding of complex diseases like cancer.

Le cellule tumorali adattano il loro metabolismo per far fronte alle richieste energetiche e biosintetiche associate alla loro maggiore crescita. Le alterazioni metaboliche nel cancro sono sotto il controllo diretto di oncogeni come ras e includono l’aumento del consumo di glucosio e glutammina, una ridotta attività mitocondriale e un aumento nella produzione di specie reattive dell’ossigeno. Poiché molecole appartenenti a molteplici cascate di vie biochimiche interconnesse sono coinvolte nel processo di oncogenesi, il cancro è una malattia della Biologia dei Sistemi che richiede l’integrazione della conoscenza derivante dai risultati sperimentali in modelli matematici. In questa tesi viene studiato l’effetto dell’attivazione dell’oncogene K-ras in fibroblasti murini NIH3T3 sul trasporto e sul metabolismo di cisteina e metionina, i due amminoacidi solforati utilizzati nella sintesi proteica. Mentre la metionina può fungere da precursore per la sintesi della cisteina, la cisteina, a sua volta, è un precursore per la biosintesi dell’antiossidante glutatione. I dati qui riportati mostrano che la limitazione e la deprivazione di cisteina causano la morte cellulare per apoptosi sia nelle cellule normali sia in quelle trasformate da K-ras (NIH-RAS), a causa dell’accumulo di specie reattive dell’ossigeno e di una diminuzione del glutatione ridotto. Soltanto il glutatione, che contiene la cisteina nella sua struttura, complementa parzialmente il difetto di crescita indotto dalla limitazione di cisteina, evidenziando così che i fibroblasti murini utilizzano la cisteina soprattutto per la sintesi del glutatione e richiedono una fonte esterna di cisteina per la sintesi proteica. Al contrario, la limitazione e la deprivazione di metionina hanno soltanto un effetto citostatico sui fibroblasti murini, il quale non viene eliminato dal glutatione. Le cellule NIH-RAS, ma non le cellule NIH3T3 da cui derivano, sono estremamente sensibili alla limitazione da metionina. Tale fragilità correla con una ridotta espressione del gene Slc6a15, che codifica per il trasportatore di nutrienti SBAT1, noto per possedere una forte preferenza per la metionina, e con una ridotta internalizzazione della metionina. Di notevole interesse è il fatto che l’espressione del gene ortologo umano SLC6A15 è per la maggior parte downregolato nelle cellule tumorali umane che costituiscono il pannello NCI-60. Un’eccezione è rappresentata dalle cellule di melanoma, nelle quali il gene SLC6A15 è fortemente upregolato. Le terapie antitumorali che prevedono la modulazione del metabolismo della metionina potrebbero, dunque, essere più efficaci nelle cellule che possiedono limitate capacità di trasporto della metionina. In seguito viene presentato lo studio dei ruoli della glutammina nel metabolismo e nell’omeostasi redox in fibroblasti murini trasformati da K-ras (NIH-RAS), tramite la complementazione della deprivazione di glutammina con dimetil-α-chetoglutarato (AKG) e amminoacidi non essenziali (NEAA). La combinazione AKG+NEAA complementa la deprivazione di glutammina e attiva il pathway di mTOR soltanto parzialmente. Tale sostituzione provoca una riduzione dei livelli di nucleotidi e, come predetto dal modello ENGRO, il mancato utilizzo della carbossilazione riduttiva dell’AKG per la sintesi dei lipidi. Il contenuto lipidico, inoltre, è minore a causa di una ridotta espressione dei geni coinvolti nella sintesi lipidica, che correla con livelli inferiori di NADPH. Nelle cellule NIH-RAS, dunque, la glutammina è essenziale come fonte di carbonio e di azoto per la biosintesi di amminoacidi, nucleotidi e glutatione, oltre che come molecola coinvolta nella biosegnalazione. E’ stato utilizzato con successo un approccio integrato di Biologia dei Sistemi per lo studio delle cellule trasformate cresciute in perturbazione nutrizionale, utile nella comprensione di malattie complesse come il cancro.