Glucose and regulation of cell cycle in saccharomyces cerevisiae: analisys of mutans impaired in sugar uptake mechanisms

Glucose and regulation of cell cycle in S. cerevisiae: analysis of mutants impaired in sugar uptake mechanisms Requisito fondamentale per la sopravvivenza di microrganismi a vita libera come il lievito S. cerevisiae è la capacità di regolare il proprio metabolismo e la progressione del ciclo cellulare in modo tale che la crescita sia rapida in presenza di abbondanti nutrienti e si arresti all’esaurirsi degli stessi. Perché questo sia possibile, nutrienti come il glucosio devono generare segnali che vengano recepiti ed elaborati dal complesso macchinario che governa il ciclo cellulare. S. cerevisiae possiede almeno tre meccanismi per rilevare variazioni dei livelli di glucosio nel mezzo di coltura: il pathway di Rgt2/Snf3, che controlla l’espressione dei trasportatori degli zuccheri esosi; il pathway cAMP/PKA, che regolando l’attività della protein-kinasi A promuove l’espressione di geni coinvolti nel metabolismo fermentativo e nella crescita cellulare e inibisce la trascrizione di geni coinvolti nella risposta agli stress; il glucose main repression pathway, che reprime l’espressione di geni coinvolti nella respirazione cellulare, nella gluconeogenesi e nell’utilizzo di fonti di carbonio alternative al glucosio. L’assunzione di glucosio nel citoplasma dall’ambiente esterno avviene attraverso i trasportatori codificati dalla famiglia di geni HXT (HeXose Transporter), che comprende almeno 20 membri: HXT1-17, RGT2, SNF3 e GAL2. Snf3 e Rgt2 sono incapaci di trasportare lo zucchero, ma agiscono piuttosto da sensori del livello di glucosio extracellulare: in particolare, Snf3 rileva basse concentrazioni dello zucchero inducendo l’espressione dei trasportatori ad alta affinità (codificati dai geni HXT2-HXT4), mentre Rgt2 rivela alte concentrazioni di glucosio promuovendo l’espressione dei trasportatori a bassa affinità (HXT1). Nessuno dei trasportatori è essenziale e solo la delezione di tutti i geni HXT (o almeno di quelli compresi tra 1-7 in alcuni background) rende la cellula di lievito incapace di crescere in presenza di glucosio come unica fonte di carbonio. L’espressione dei vari trasportatori è regolata a livello trascrizionale attraverso un complesso network che coinvolge tutti e tre pathway deputati al sensing del glucosio: come risultato, S. Cerevisiae è in grado di mantenere sempre un alto flusso glicolitico esprimendo il set di trasportatori più adatto alla quantità di glucosio disponibile. Le connessioni tra i pathway deputati al sensing del glucosio e gli elementi di regolazione del ciclo cellulare non sono completamente definite, anche perché risulta spesso difficile scindere il duplice ruolo dello zucchero come nutriente e come molecola segnale. Obbiettivo del presente progetto di ricerca è chiarire gli effetti di alterazioni nei meccanismi di sensing e (in modo particolare) di trasporto del glucosio sulla coordinazione tra crescita e divisione cellulare. In una prima fase dello studio sono stati presi in esame alcuni mutanti con delezioni nei geni HXT1-7, codificanti per i principali trasportatori degli zuccheri esosi: i dati presenti in letteratura certificano infatti come queste mutazioni siano sufficienti ad abolire sostanzialmente l’assunzione (uptake) cellulare del glucosio impedendo la crescita dei mutanti su tale fonte di carbonio. I parametri di crescita (tempo di duplicazione, indice di gemmazione, contenuto proteico e di DNA) di ciascuno dei ceppi sono stati determinati in due condizioni sperimentali: i) crescita esponenziale bilanciata in terreno csm/YNB addizionato di 2% etanolo o di una miscela 2% Etanolo + 2% glucosio, da cui è emerso come il glucosio possa esercitare un effetto sulle dimensioni celulari anche nei mutanti hxt (indipendente quindi dal suo ruolo come nutriente). Infatti, analogamente alle cellule wild-type, anche i ceppi con i trasportatori deleti mostrano dimensioni cellulari e contenuto proteico maggiore quando fatti crescere in glucosio+Etanolo, sebbene (diversamente dal ceppo wild type) la loro velocità di crescita sia simile a quella registrata in terreno con solo etanolo; ii) crescita durante shift-up nutrizionale etanolo => glucosio. All’aggiunta dello zucchero le cellule wild-type vanno incontro ad fase iniziale di adattamento (evidenziato dalla diminuzione transiente (10-15%) dell’indice di gemmazione), necessaria per reimpostare profilo trascrizionale, velocità di crescita e dimensioni cellulari e per il successivo passaggio ad un metabolismo energetico di tipo fermentativo. A differenza del ceppo wild type, dopo l’aggiunta di glucosio le cellule hxt(1-7) manifestano una drammatica e prolungata riduzione nell’indice di gemmazione e un forte rallentamento (arresto) nella progressione del ciclo cellulare. In seguito le cellule riprendono a dividersi con una velocità sostanzialmente identica a quella precedente lo shift, mentre volume cellulare e contenuto proteico medio aumentano sensibilmente: l’effetto del glucosio sulle dimensioni cellulari dei mutanti hxt(1-7) è tuttavia transiente e si esaurisce nell’arco di due/tre round di divisioni, quando le cellule tornano ad assumere le dimensioni tipiche della crescita su etanolo. I dati finora riportati sembrano quindi suggerire che, almeno inizialmente, gli effetti del glucosio sulle dimensioni cellulari dipendano dal sensing dello zucchero e non dal suo metabolismo. Tuttavia, sebbene il ceppo hxt(1-7) non sia in grado di crescere su glucosio come unica fonte, rimane comunque dotato di una capacità residua di trasporto dello zucchero, che sebbene insufficiente a sostenere il metabolismo glicolitico, potrebbe comunque assumere un’importanza decisiva per la regolazione delle dimensioni cellulari. Nel tentativo di scindere ancora più nettamente il duplice ruolo del glucosio come nutriente e come molecola segnale, in una successiva fase di studi sono stati utilizzati mutanti con delezioni in tutti i geni per i trasportatori del glucosio (hxt(1-17)), in cui ogni residuo trasporto dello zucchero risulta abolito. In aggiunta, si sono presi in esame una serie di mutanti con una capacità di uptake del glucosio progressivamente ridotta: nel dettaglio, la lista comprende (oltre ovviamente al ceppo wild type di riferimento): i) hxt(1-17)gal2, in cui il trasporto del glucosio è completamente abolito; ii) il ceppo hxt(1-17)) snf3, in cui l’inattivazione del sensore SNF3 rispristina una trascurabile capacità di trasporto del glucosio, insufficiente comunque a garantire la crescita in terreno liquido contenente glucosio come unica fonte: l’assunzione dello zucchero in questo caso sembrerebbe avvenire attraverso un trasportatore non ancora caratterizzato, la cui trascrizione risulta derepressa in assenza di SNF3; iii) il ceppo (hxt(1-17) gal2 HXT1, che esprime in modo costitutivo come unico trasportatore HXT1, un carrier a bassa affinità; iv) ) il ceppo (hxt(1-17) gal2 HXT7, che esprime in modo costitutivo come unico trasportatore HXT7, un carrier ad alta affinità; v) il ceppo snf3 rgt2, in cui l’uptake del glucosio è ridotto a causa dell’inattivazione del principale pathway che regola l’espressione dei maggiori trasportatori; vi) il triplo deleto hxk2 hxk1 glk1, che è in grado di trasportare glucosio nel citoplasma ma non è in grado di metabolizzarlo a causa dell’assenza di tutte e tre le chinasi che catalizzano il primo passaggio della glicolisi. I ceppi sopra elencati sono stati sottoposti alle analisi descritte in precedenza. Nel caso dei ceppi capaci di metabolizzare il glucosio, il tasso di crescita e le dimensioni cellulari su tale fonte sono generalmente correlate all’efficienza del sistema di trasporto dello zucchero nei vari mutanti: sembra esistere una relazione sostanzialmente lineare tra velocià di consumo del glucosio/velocità di crescita/dimensioni cellulari. Unica eccezione pare essere il ceppo snf3 rgt2, che manifesta dimensioni cellulari notevolmente più ridotte rispetto a quanto atteso sulla base del suo tasso di crescita: un risultato che sembrerebbe suggerire un ruolo diretto del pathway Snf3/Rgt3 nei meccanismi che regolano le dimensioni cellulari in risposta ai nutrienti. Diversamente da quanto emerso in precedenza, la crescita dei mutanti hxt(1-17) risulta fortemente inibita in terreni contenenti miscele di etanolo (o altra fonte non fermentabile) e glucosio, anche quando la concentrazione dello zucchero è a livelli sub-ottimali (0.05% anziché 2%). L’aggiunta di glucosio a cellule hxt(1-17) in crescita su etanolo (shift-up nutrizionale) determina l’arresto permanente del ciclo cellulare in G1 (cellule vitali, non gemmate con contenuto di DNA presintetico). Sembra quindi che la semplice presenza di glucosio nell’ambiente extracellulare - ma non il trasporto dello zucchero nel citoplasma - sia sufficiente ad impedire l’utilizzo di fonti di carbonio alternative presenti nel medium: ciò spiegherebbe la mancata crescita in terreni misti glucosio+etanolo da parte di cellule hxt(1-17), incapaci di effettuare l’uptake dello zucchero. Se tale ipotesi fosse corretta, inattivando contemporaneamente tutti i pathway deputati al sensing del glucosio dovrebbe essere possibile ripristinare la crescita di cellule hxt(1-17) in terreni contenenti miscele di glucosio ed etanolo. Al momento, si è appurato che l’inattivazione del ramo del cAMP/PKA pathway passante attraverso Gpr1/Gpa2 non è sufficiente a correggere il difetto di crescita del ceppo hxt(1-17)gal2 in fonte mista glucosio/etanolo. Al contrario, la semplice inattivazione di SNF3 (ma non di RGT2)sembra sostanzialmente azzerare l’effetto citostatico del glucosio sulla crescita del ceppo hxt(1-17) gal2 snf3. L’interpretazione di tale risultato è ovviamente complicata dal fatto che la delezione di SNF3 ripristina parzialmente il trasporto del gluccosio in un ceppo privo di tutti i trasportatori, sebbene, vale la pena ricordare, su scala estremamente ridotta e comunque insufficiente a sostenere la crescita, come confermato attraverso misurazioni dirette della velocità di consumo delo zucchero nel ceppo hxt(1-17)) snf3. Tuttavia, diversi dati in letteratura suggeriscono come il pathway Snf3/Rgt2 partecipi in qualche misura ai meccanismi della glucose repression, in particolare attrverso Mig2, un repressore trascrizionale che in presenza di glucosio collabora con Mig1 nel reprimere la trascrizione di geni richiesti per l’utilizo di fonti di carbonio alternative. La delezione di MIG2 non è tuttavia sufficiente a ripristinare la crescita su etanolo/glucosio del ceppo hxt(1-17)gal2: ulteriori indagini sono dunque necessarie per chiarire quale sia il ruolo giocato da SNF3 nell’intero processo. In aggiunta, il comportamento manifestato dal ceppo hxk2 hxk1 glk1 durante shift-up nutrizionale da etanolo a glucosio sembra ulteriormente confermare come in lievito lo zucchero sia in grado di regolare le dimensioni cellulari indipendentemente dal proprio metabolismo, almeno in una fase iniziale: le cellule hxk2 hxk1 glk1 in crescita su etanolo rispondono all’aggiunta di glucosio aumentando considerevolmente il proprio volume, in misura paragonabile a quanto si registra nel ceppo wild type; tuttavia, contrariamente al ceppo wild type, nel mutante hxk2 hxk1 glk1 l’aumento delle dimensioni celluari si accompagna ad un progressivo rallentamento della velocità di crescita, fino ad un totale arresto del ciclo di divisione cellulare che sopraggiunge a circa 12 ore dallo shift. Dopo una fase di lag piuttosto prolungata ed estremamente variabile, in cui le cellule, pur non dividendosi, si mantengono gemmate, si assiste alla rispresa del ciclo di divisione cellulare: le cellule tornano a dividersi lentamente utilizzando l’etanolo residuo nel terreno e nell’arco di due/tre generazioni assumono nuovamente le tipiche dimensioni ridotte associate alla crescita su fonte di carbonio non fermentabile. Ad ulteriore conferma di come l’effetto del glucosio sia solo temporaneo, dimensioni e contenuto proteico di cellule hxk2 hxk1 glk1 in crescita bilanciata su etanolo o su fonte mista etanolo/glucosio sono sostanzialmente identiche. Nonostante il sorprendente effetto citostativo dello zucchero, l’aumento delle dimensioni cellulari in risposta all’aggiunta di glucosio si manifesta anche nel ceppo privo di tutti i trasportatori (hxt(1-17) gal2)., sebbene in misura meno eclatante rispetto al triplo mutante hxk2 hxk1 glk1. Nell'insieme, tali risultati sembrano confermare come il glucosio sia in grado di modulare le dimensioni della cellula di lievito in maniera (almeno in parte) indipendente dal proprio ruolo come nutriente, funzionando in buona sostanza come un "ormone". Per chiarire le basi molecolari di tale fenomeno è necessario chiarire le connessioni tra i pathway deputati al sensing del glucosio e gli elementi di regolazione del ciclo di divisione cellulare in S. cerevisiae. A tal fine, si è ultimata la costruzione di una serie di mutanti esprimenti versioni “taggate” (HA-tag) di alcuni dei principali regolatori coinvolti nella transizione G1/S (nello specifico Cln3, Cln2, Far1, Sic1 e Clb5), così da facilitare l’analisi dei loro livelli di espressione e di localizzazione subcellulare. Gli studi in questo senso sono tuttavia in una fase ancora troppo preliminare per poter trarre conclusioni definitive. Da utlimo, si è cercato di valutare il contributo relativo di sensing, trasporto e metabolismo del glucosio alla regolazione trascrizionale del gene SUC2, uno dei marcatori più comunemente utilizzati per valutare il fenomeno della glucose repression in S. cerevisiae. SUC2 codifica per l’invertasi, un enzima chiave per l’utilizzo del disaccaride saccarosio e la sua espressione risulta completamente bloccata in presenza di alti livelli di glucosio mentre viene indotta da raffinosio o da bassi livelli di glucosio. I risultati ottenuti con i vari mutanti hanno evidenziato come in presenza di abbondante glucosio il livello basale di attività invertasica sia generalmente proporzionale alla velocità del flusso glicolitico, che dipende in larga misura dalla capacità di trasporto dello zucchero: nei ceppi aventi un sistema di uptake per il glucosio ad efficienza ridotta l’invertasi risulta parzialmente o addirittura competamente derepressa, come nel caso del mutante privo di tutti i trasportatori. Il ceppo snf3 rgt2 sfugge invece a questa regola, in quanto l’attività invertasica risulta sì parzialmente derepressa in presenza di alte concentrazioni di glucosio, ma non più inducibile da bassi livelli di glucosio o raffinosio. In aggiunta, l’inattivazione di SNF3 e di RGT2 abolisce completamente l’induzione dell’attività invertasica nel ceppo hxt(1-17)gal2 in presenza di glucosio. Nell’insieme, i dati appena descritti sembrano suggerire per il pathway Snf3/Rgt2 un ruolo decisamente più rilevante nella regolazione di SUC2 rispetto a quanto gli viene comunemente attribuito. Esperimenti futuri permetteranno di chiarire meglio la questione.