Multiphoton multifocal methods for neuroscience and hemodynamics

La microscopia di fluorescenza è una tecnica molto usata in ricerca e sviluppo in campo biomedico, grazie alla sua versatilità, al suo alto contrasto, e alla sua compatibilità con l’utilizzo in campioni biologici attivi. Recentemente, numerose varianti della microscopia di fluorescenza sono state sviluppate per migliorare la selettività e la qualità delle informzioni acquisite. Dal momento che la maggioranza dei sistemi biologici evolve su scale temporali lente (secondi), la risoluzione temporale è spesso sacrificata per migliorare altri parametri dell’acquisizione. Alcuni importanti processi biologici, come per esempio l’attività neurale, la diffusione molecolare e la circolazione sanguigna, agiscono su scale temporali del millisecondo. Questa tesi illustra due tecniche di microscopia di fluorescenza appositamente sviluppate per lo studio di fenomeni veloci in organismi viventi, e riporta risultati sperimentali inediti ottenuti ottenuti osservando il flusso sanguino in embrioni di zebrafish, e l’attività neuronale in tessuto cerebellare di ratto Wistar. Per studiare il flusso sanguigno in modelli animali (embrioni di zebrafish) è stata utilizzata la cross correlazione spaziale di fluorescenza (sFCCS), una variante della spettroscopia di correlazione della fluorescenza classica, basata sullo studio statistico delle fluttuazioni delsegnale di fluorescenza acquisito in due punti distinti nel campo visivo del microscopio. La teoria dell’ sFCCS è riportata in letteratura, ma il suo utilizzo pratico è sempre stato limitato all’uso in semplici sistemi “in vitro”, in quanto il setup sperimentale classico, basato sull’uso di beam splitter fissi e di un doppio fotodiodio, è di complessa realizzazione e allineamento, e non permette di realizzare un’immagine del campione, né di posizionare con precisione i due volumi di eccitazione. Il setup alternativo presntto in questa tesi, basato sull’uso di un electron multiplying charged couple device (EMCCD), un interferometro modificato per il posizionamento dei punti focali, e uno scanner galvanometrico per l’imaging, è più versatile e di più semplice realizzazione, e permette di acquisire un’immagine confocale del campione, e di scegliere su di essa le posizioni dei due volumi di eccitazione. Tale setup è stato utilizzato per misure su embrioni di zebrafish, misurando le dinamiche del moto cardiaco, le velocità di flussi, e fornendo stime dello shear stress nei vasi sanguigni. Per lo studio delle reti neuronali cerebellari, invece, questa tesi descrive un metodo originale ed estremamente innovativo, per il calcium imaging a due fotoni ad alta velocità. Il calcium imaging è una tecnica basata sulla colorazione dei tessuti con coloranti fluorescenti che cambiano la loro emissione dipendentemente dalla concentrazione di calcio intracellulare; nella sua forma classica il calcium imaging a due fotoni richiede l’us di uno scanner galvanometrico, la cui limitata velocità di movimento costringe a scegliere fra l’acquisizione di segnali ad alta velocità su singole linee, oppure l’acquisizione su grandi campi visivi a non più di qualche immagine al secondo. La tecnica riportata in questa tesi è basata sull’uso di un sensore sCMOS ad alta velocità e su un modulatore spaziale di luce, strumento olografico che permette di creare un numero arbitrario di volumi di eccitazione in qualsiasi posizione all’interno del campo visivo. Mediante questo sistema è possibile acquisire un’immagine confocale del campione, selezionare alcuni punti di interesse, ed acquisire segnali di calcio da tali punti simultaneamente e su scale temporali del millisecondo. Il sistema è stato utilizzato con successo per studiare l’organizzazione spaziale dei segnali, del bilanciamento fra eccitazione ed inibizione, e della plasticità sinaptica.