Characterization and isolation of fetal cells for non-invasive prenatal diagnosis through Gravitational Field-Flow Fractionation

Non-invasive prenatal diagnosis (NIPD) aims to provide genetic information about the fetus without risking the health of the mother or future child, offering a safer alternative to invasive procedures such as amniocentesis or chorionic villus sampling. A promising NIPD method, patented in 2013 by Dr. Lattuada, utilizes Gravitational Field-Flow Fractionation (GrFFF), a physical method that separates cells in a laminar flow channel by exploiting gravitational force under physiological condition and based on cells morphology. This doctoral thesis focuses on optimizing GrFFF for the enrichment of fetal erythroblasts from maternal blood, a critical goal in NIPD due to the rarity and diagnostic potential of these cells. The research consists of three interrelated studies, each dedicated to different aspects of GrFFF optimization. The first study focused on measuring cells from cord blood to establish a dataset on cell size, a key factor in GrFFF-based separation. Most existing data pertain to fixed cells, which shrink due to chemical fixatives. This study addressed a gap in the literature by measuring cells both under physiological conditions, using two different anticoagulants, and in a fixed state, totaling 2,071 cells. The study not only provides new data for computational GrFFF simulations but also confirmed that erythroblasts are the largest circulating cells, with a higher cytoplasmic content than any other nucleated cells, laying the foundation for subsequent studies. Given the importance of physical principles in GrFFF, the following studies explored the role of carrier fluid viscosity, which influences how fast cells elute from the channel. Initially, polystyrene beads were used as a model system to investigate how variations in viscosity, achieved through the addition of methylcellulose (MC) and temperature adjustments, affect particle retention times and separation resolution. The results demonstrated that viscosity plays a crucial role in GrFFF, and that the addition of MC statistically significantly improved resolution, suggesting a secondary effect unrelated to viscosity. These findings provided a foundation for applying similar approaches to biological samples. Subsequently, the impact of MC-modified viscosity was evaluated on human cord blood cells. The experiments focused on its effect on the separation of both individual cell populations—lymphocytes, neutrophils, and erythrocytes—and on buffy coat samples. The results showed that MC reduced retention times for all cell types, with the degree of reduction directly proportional to the nucleus-to- II cytoplasm ratio. In the presence of MC, a statistically significant increase in the recovery of fetal erythroblasts was observed, confirming previous findings and complementing them with our data on the morphology of erythroblasts, previously studied. This result highlights the key role of viscosity in GrFFF-based separation and encourages further optimizations of GrFFF for NIPD. In conclusion, this thesis presents fundamental insights into optimizing GrFFF for fetal erythroblast isolation for NIPD. The findings not only enhance GrFFF for prenatal diagnostics but also provide knowledge for broader applications in cell separation, where gentle, morphology-based techniques are required.

La diagnosi prenatale non invasiva (NIPD) mira a fornire informazioni genetiche sul feto senza rischi per la salute della madre o del nascituro, offrendo un’alternativa più sicura rispetto a procedure invasive come l’amniocentesi o il prelievo dei villi coriali. Un metodo promettente per la NIPD, brevettato nel 2013 dalla Dr.ssa Lattuada, utilizza il Frazionamento in Campo-Flusso Gravitazionale (GrFFF), un metodo fisico che separa le cellule in condizioni fisiologiche in un canale a flusso laminare sfruttando la forza gravitazionale e basandosi sulla morfologia cellulare. Questa tesi di dottorato si concentra sull’ottimizzazione del GrFFF per l’arricchimento degli eritroblasti fetali dal sangue materno, un obiettivo cruciale nella NIPD data la rarità e il potenziale diagnostico di queste cellule. La ricerca si compone di tre studi correlati, ciascuno dedicato a diversi aspetti dell’ottimizzazione del GrFFF. Il primo studio si è focalizzato sulla misurazione delle cellule da sangue cordonale per fornire un dataset sulle dimensioni cellulari, un fattore chiave per la separazione basata su GrFFF. La maggior parte dei dati esistenti riguarda cellule fissate, che si restringono a causa dei fissativi chimici. Questo studio ha colmato una lacuna nella letteratura misurando le cellule sia in condizioni fisiologiche, utilizzando due diversi anticoagulanti, sia fissate, per un totale di 2.071 cellule. Lo studio, non solo fornisce nuovi dati per le simulazioni computazionali del GrFFF, ma conferma anche che gli eritroblasti sono le cellule circolanti più grandi, con un contenuto citoplasmatico maggiore rispetto a qualsiasi altra cellula nucleata, ponendo le basi per gli studi successivi. Data l'importanza dei principi fisici nel GrFFF, gli studi successivi hanno esplorato il ruolo della viscosità del fluido carrier, che influenza la velocità con cui le cellule eluiscono dal canale. Inizialmente, sono state utilizzate biglie di polistirene come sistema modello per studiare come le variazioni della viscosità, ottenute tramite l’aggiunta di metilcellulosa (MC) e regolazioni della temperatura, influenzino i tempi di ritenzione delle particelle e la risoluzione della separazione. I risultati hanno dimostrato che la viscosità svolge un ruolo cruciale nel GrFFF e che l'aggiunta di MC ha migliorato in modo statisticamente significativo la risoluzione, suggerendo un suo effetto secondario non correlato alla viscosità. Questi risultati hanno fornito una base per applicare approcci simili a campioni biologici. Successivamente, l'impatto della viscosità modificata da MC è stato valutato su cellule di sangue cordonale umano. Gli esperimenti si sono concentrati sul suo effetto nella separazione di popolazioni cellulari omogenee (linfociti, neutrofili ed eritrociti) e su campioni di buffy coat. I risultati hanno mostrato che l'MC ha ridotto i tempi di ritenzione per tutti i tipi cellulari, con una riduzione proporzionale al rapporto nucleo-citoplasma. In presenza di MC, è stato osservato un incremento statisticamente significativo nel recupero degli eritroblasti fetali, confermando osservazioni precedenti e integrandole con i dati sulla morfologia degli eritroblasti, precedentemente studiati. Questo risultato evidenzia il ruolo chiave della viscosità nella separazione basata su GrFFF e incoraggia ulteriori ottimizzazioni del GrFFF per la NIPD. In conclusione, questa tesi presenta approfondimenti fondamentali sull'ottimizzazione del GrFFF per l'isolamento degli eritroblasti fetali per la NIPD. I risultati non solo migliorano la GrFFF per la diagnostica prenatale, ma forniscono anche conoscenze utili per applicazioni più ampie nella separazione cellulare, dove sono richieste tecniche delicate basate sulla morfologia.