New biomolecular strategies for the monitoring of biodegradation processes and for the remediation of contaminated sites

Bioremediation is an environmental remediation technique that exploits the natural ability of microorganisms to transform and remove contaminants. The main strategies include biostimulation, to promote the growth and activity of the native microbial community, and bioaugmentation, consisting in the addition of microbial strains with the specific capabilities to the treated matrix. Both technologies require a detailed site-specific analysis of the microbial community metabolisms: for biostimulation, to assess the presence and activity of target microorganisms; for bioaugmentation, to verify the microbial inocula persistence. Currently, the molecular approach is the most effective method for studying microbial communities. In detail, quantitative PCR (qPCR) enables to quantify specific genes (biomarkers) related to taxonomical groups or metabolic pathways of interest. By knowing the target gene sequences, the design of specific primers and thus the development of new biomarkers useful in various stages of the remediation process is possible. This PhD work presents the primer design for the qPCR technique applied in two different cases: the estimation of the natural genetic potential for caprolactam biodegradation in a contaminated site, and the evaluation of inocula persistence in a project concerning the development of a biochar-based product to be applied in bioaugmentation strategies. Caprolactam is a contaminant associated with nylon production and it can be found in groundwater due to its improper handling/disposal. Since its biodegradation process is still not clear, a methodology to assess the biodegradation potential is essential. To this end, a marker gene for the aerobic pathway for caprolactam degradation was identified through a bibliographic study. Specific primers for the gene encoding caprolactamase, the main enzyme involved in the best known biodegradation pathway, were designed for application in qPCR technique. The methodology was applied to characterise the contaminated site used as case-study for its development. A laboratory test was carried out to better understand the biodegradation processes and find a possible solution to stimulate them. Thanks to the developed methodology and its application, the site was evaluated as not suitable for the application of a biological remediation strategy for the removal of caprolactam. The second part of the PhD project concerns the development of a Microbial activated Biochar (MaB) product for soil bioremediation, where biochar is used as carrier for the inoculation of the degrading strains, promoting their persistence. Promising strains were isolated and phenotypically and genotypically characterised. To monitor their persistence in the treated matrix after inoculation, strain-specific primers were designed for qPCR analysis. Lab and pilot-scale tests were carried out to assess their application effectiveness in real cases and confirm strain specific primers efficacy in detecting and quantify the inoculated strains over time, even in extreme situations, making them a useful tool for bioaugmentation persistence evaluation.

Il biorisanamento è una tecnica di bonifica ambientale che sfrutta la capacità naturale dei microrganismi di trasformare e rimuovere i contaminanti. Le strategie principali includono la biostimulation, che stimola la crescita e l'attività della comunità microbica naturalmente presente nella matrice trattata, e la bioaugmentation, che consiste invece nell'aggiunta di ceppi microbici selezionati sulla base di caratteristiche d’interesse. Entrambi i metodi richiedono un'analisi dettagliata sito-specifica dei metabolismi della comunità microbica: nella biostimulation, per valutare la presenza e l'attività dei microrganismi target; nel bioaugmentation, per verificare la persistenza dell'inoculo. Attualmente, l'approccio molecolare è il metodo più efficace per studiare le comunità microbiche. In particolare, la PCR quantitativa (qPCR) consente di quantificare specifici geni (biomarcatori) correlati a gruppi tassonomici o metabolici di interesse. La conoscenza delle sequenze dei geni target consente di disegnare primer specifici e quindi sviluppare nuovi biomarcatori utili nelle varie fasi del processo di bonifica. Questo lavoro presenta il disegno di primer da utilizzare in qPCR ed applicato in due strategie diverse: nel primo caso la metodologia sviluppata è utilizzata per valutare il potenziale genetico naturale in un sito contaminato per la biodegradazione del caprolattame; nel secondo caso lo scopo è valutare la persistenza dell'inoculo in un progetto riguardante lo sviluppo di un prodotto a base di biochar da applicare in strategie di bioaugmentation. Il caprolattame è un contaminante associato alla produzione di nylon e si trova nelle falde acquifere a causa di una sua scorretta gestione/smaltimento. Poiché il suo processo di biodegradazione è ancora in fase di comprensione, risulta particolarmente utile una metodologia che consenta di valutare il potenziale di biodegradazione delle matrici contaminate. A tal fine, attraverso uno studio bibliografico, è stato ricercato un possibile gene marcatore per degradazione del caprolattame, identificato nel gene che codifica per la caprolattamasi, l'enzima principale coinvolto nella via di biodegradazione aerobica più nota. Sono stati progettati primer specifici per rilevare e quantificare tale gene tramite la tecnica di qPCR. La metodologia è stata applicata per caratterizzare il sito contaminato utilizzato come caso-studio per il suo sviluppo. È stato inoltre effettuato un test di laboratorio per comprendere meglio i processi di biodegradazione e trovare una possibile soluzione per stimolarli. Grazie alla metodologia sviluppata e alla sua applicazione è stato possibile possibile valutare che il sito indagato non è adatto all'applicazione di una strategia di bonifica biologica per la rimozione del caprolattame. La seconda parte del progetto riguarda lo sviluppo di un prodotto per il biorisanamento del suolo, denominato Microbial activated Biochar (MaB), dove il biochar viene utilizzato come vettore per l'inoculazione dei ceppi microbici degradativi, promuovendone la persistenza. I ceppi più promettenti sono stati isolati e caratterizzati fenotipicamente e genotipicamente. Per monitorare la loro persistenza nella matrice trattata dopo l'inoculazione, sono stati progettati primer ceppo-specifici per l'analisi di qPCR. Sono stati realizzati test sia su scala di laboratorio che su scala pilota per verificarne l'efficacia in casi reali. Le analisi svolte hanno confermato l'efficienza della metodica sviluppata nel rilevare e quantificare i ceppi inoculati nel tempo, anche in situazioni estreme, rendendola uno strumento utile per la valutazione della persistenza in strategie di bioaugmentation.