T and B lymphocyte clonal dynamics in the memory phase and in the immune response studied at single-cell resolution

B and T lymphocytes are the central players of adaptive immunity, covering distinct roles in recognizing and responding to diverse pathogens through clonal expansion and the generation of memory and effector cells. This thesis investigates the dynamics of B and T cell activation, clonal evolution, and memory establishment using single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) together with T cell receptor (TCR) or B cell receptor (BCR) repertoire analysis. Our study spans various conditions, from the steady-state of immune maintenance, to the responses following exposure to Influenza and SARS-CoV-2 antigens. We analyzed age-dependent changes in the phenotypic and clonal composition of CD4+ and CD8+ T cells from four healthy donors aged 27 to 73 and observed that each had an individual distribution of cells in the different subsets according to age. Moreover, clonal expansion was significantly increased in older individuals, where some clonotypes dominated a large portion of the T cell repertoire. We also mapped antigen-specific clonotypes and observed how their phenotype differed depending on the antigen. We focused on the relationship between memory B cells and circulating plasmablasts, analyzing samples from two healthy donors over multiple years. Our findings showed that the memory B cell repertoire was dominated by large IgM, IgA, and IgG2 clonal families, while IgG1 families, including those specific for recalled antigens, were smaller. In addition, we analysed the BCR repertoire of longitudinal samples and followed the stability of these clonal families over time, as well as the emergence of plasmablasts derived from long-term memory, B cell families. These finding suggested that memory B cells remain active in generating new plasmablasts in order to maintain their original pool. By analyzing recently activated T cells and plasmablasts collected six days after antigen exposure to Influenza and SARS-CoV-2, we identified two distinct modes of immune activation: (i) rapid, antigen-driven clonal expansion and (ii) homeostatic, low-rate proliferation during steady-state conditions. We also observed a significant shift in isotype expression among recently activated plasmablasts after antigenic stimulation, with an increased prevalence of IgA1 and IgG1, indicating a robust secondary immune response. In contrast, the steady-state condition showed a more heterogeneous distribution of isotypes and different clonal proliferation patterns. Collectively, this study provides a comprehensive view of the dynamic nature of the human immune system, with a focus on the differences between antigen-specific responses and homeostatic maintenance. These results contribute to our understanding of immune memory and adaptation over time, offering valuable insights for improving vaccine strategies and therapeutic interventions in infectious diseases and immune-related disorders.

I linfociti B e T sono attori centrali dell'immunità adattativa e ricoprono ruoli distinti nel riconoscere e rispondere a diversi agenti patogeni attraverso l'espansione clonale e la generazione di cellule memoria ed effettrici. Questa tesi indaga le dinamiche dell'attivazione delle cellule B e T, l'evoluzione clonale e l'instaurazione della memoria utilizzando il sequenziamento dell'RNA di una singola cellula (scRNA-seq) insieme all'analisi del repertorio dei recettori delle cellule T (TCR) o B (BCR). Il nostro studio spazia tra diverse condizioni, dallo stato stazionario di mantenimento immunitario alle risposte dopo l'esposizione ad antigeni dell'influenza e del SARS-CoV-2. Abbiamo analizzato i cambiamenti dipendenti dall'età nella composizione fenotipica e clonale delle cellule T CD4+ e CD8+ di quattro donatori sani di età compresa tra i 27 e i 73 anni e abbiamo osservato che ciascuno di essi aveva una distribuzione individuale di cellule nelle diverse sottopopolazioni in base all'età. Inoltre, l'espansione clonale è risultata significativamente maggiore negli individui più anziani, dove alcuni clonotipi dominavano un'ampia porzione del repertorio delle cellule T. Abbiamo anche mappato i clonotipi specifici per l'antigene e osservato come il loro fenotipo differisse a seconda dell'antigene. Ci siamo concentrati sulla relazione tra le cellule B della memoria e i plasmablasti circolanti, analizzando i campioni di due donatori sani per diversi anni. I nostri risultati hanno mostrato che il repertorio delle cellule B della memoria è dominato da grandi famiglie clonali IgM, IgA e IgG2, mentre le famiglie IgG1, comprese quelle specifiche per gli antigeni richiamati, sono più piccole. Inoltre, abbiamo analizzato il repertorio BCR di campioni longitudinali e abbiamo seguito la stabilità di queste famiglie clonali nel tempo, nonché l'emergere di plasmablasti derivati da famiglie di cellule B con memoria a lungo termine. Questi risultati suggeriscono che le cellule B della memoria rimangono attive nel generare nuovi plasmablasti per mantenere il loro pool originale. Analizzando i linfociti T e i plasmablasti recentemente attivati, raccolti sei giorni dopo l'esposizione all'antigene dell'influenza e del SARS-CoV-2, abbiamo identificato due modalità distinte di attivazione immunitaria: (i) un'espansione clonale rapida e guidata dall'antigene e (ii) una proliferazione omeostatica a basso tasso in condizioni di stato stazionario. Abbiamo anche osservato un significativo cambiamento dell'espressione isotipica tra i plasmablasti recentemente attivati dopo la stimolazione antigenica, con una maggiore prevalenza di IgA1 e IgG1, a indicare una robusta risposta immunitaria secondaria. Al contrario, la condizione di stato stazionario ha mostrato una distribuzione più eterogenea degli isotipi e diversi modelli di proliferazione clonale. Nel complesso, questo studio fornisce una visione completa della natura dinamica del sistema immunitario umano, con particolare attenzione alle differenze tra le risposte antigene-specifiche e il mantenimento omeostatico. Questi risultati contribuiscono alla comprensione della memoria immunitaria e dell'adattamento nel tempo, offrendo spunti preziosi per migliorare le strategie vaccinali e gli interventi terapeutici nelle malattie infettive e nei disturbi immunocorrelati.