In vitro and in vivo studies on ETV6::RUNX1 pre-leukemic cells under basal and inflammatory conditions

ETV6::RUNX1(E/R) fusion gene, arising in utero from t(12;21), is the most frequent alteration in childhood acute lymphoblastic leukemia (ALL). However, ETV6::RUNX1 is insufficient to overt disease and additional genetic lesions can trigger leukemia development in 1% of ETV6::RUNX1 cases. Dysregulated inflammatory and immune response to common infection is thought to be the major player in ETV6::RUNX1 malignant transformation, driving the acquisition of secondary mutations. Thus, we aim to comprehend the role of infection(s)/inflammation, in the hematopoietic niche, on the pathogenesis of the disease. In particular, we took advantage of both in vitro and in vivo models. We set up an in vitro model of competitive mesenchymal niche to study E/R+ pre-leukemic cells and BM microenvironment crosstalk. We co-cultured BaF3 proB cell line expressing E/R and control Ba/F3 (ratio of 80:20%) on BM-MSCs. We reproduced inflammatory conditions by treating competitive niche model with IL6/IL1β/TNFα pro-inflammatory cytokines. Following cytokines stimulation, we found that BM-MSCs strongly attract E/R+ Ba/F3 in a CXCR2-dependent manner. in addition, inflamed niche model lead DNA damage in both populations but while control cells undergo apoptosis, E/R+ Ba/F3 survive and can develop additionally genetic lesions (Beneforti L, et al. 2020). To confirm our in vitro results, we took advantage of a Sca1-ETV6-RUNX1 transgenic mouse model. These mice shifted from a specific pathogen free facility (SPF) to the conventional facility (CF) can develop B-ALL at low penetrance, thus resembling the human condition (Rodríguez-Hernandez G. et al. 2017). In order to explore the short- and the long-term impact of the infection on the immature compartment, we firstly determined the frequency of HSPCs (Lin- Sca1+c-Kit+ (LSK)) and long-term HSCs (LT-HSCs: LSK CD48-CD150+) in the bone marrow (BM) of mice housed in the CF for 4 and 12 weeks. After shifting the mice to the CF, we observed that while the short-term exposure did not affect both HSPCs and LT-HSCs frequency, the long-term exposure induced a sharp increase only in the LT-HSCs compartment of Sca1-ETV6-RUNX1 mice. Moreover, when the mice were exposed to infection, we found that ETV6::RUNX1 HSPCs egress to the peripheral blood (PB) reaching the highest peak between 4 and 8 weeks. Circulating cells showed higher ROS levels compared to BM cells, especially of pre-leukemic cells which in turn can lead to the acquisition of additional genetic lesions. Moreover, ETV6::RUNX1 pre-leukemic cells showed altered chemotactic response toward CXCL12, a chemokine involved in the retention of immature cells in the BM. Finally, we assessed the cytokines profile of BM and PB of mice housed in SPF and CF. Among the 32 cytokines analyzed, we found the up-regulation of IL9, G-CSF and IL1 in the PB serum only in WT mice moved to CF, while in the BM we did not find any cytokines differentially secreted. Taken together both in vitro and in vivo results showed that infection/inflammation can modify ETV6::RUNX1 pre-leukemic cells behavior and eventually guide the acquisition of further genetic lesions, but further studies, especially with the in vivo model, are essential to understand the role of infection/inflammation in the maintenance of the covert disease as well as in stimulating the molecular changes that lead to leukemia onset.

Il gene di fusione ETV6::RUNX1 (E/R), generato durante la vita fetale dalla t(12;21), è l’alterazione più frequente nella leucemia linfoblastica acuta infantile (LLA). Tuttavia, E/R non è sufficiente per determinare l’insorgenza della malattia, ma ulteriori mutazioni sono necessarie per causare la leucemia nell’1% dei casi E/R +. Si ritiene che la causa della malattia sia da attribuire ad una risposta infiammatoria e immunitaria aberrante nei confronti di patogeni comuni, la quale può guidare la trasformazione maligna delle cellule pre-leucemiche E/R+, tramite l’acquisizione di mutazioni secondarie. Pertanto, l’obiettivo di questo lavoro è stato quello di meglio comprendere il ruolo delle infezioni/infiammazioni, nel contesto della nicchia ematopoietica, nella patogenesi della malattia. Per fare ciò, ci siamo avvalsi dell’utilizzo di due modelli uno in vitro ed uno in vivo. Il modello in vitro di nicchia mesenchimale competitiva è stato utilizzato per studiare le caratteristiche delle cellule pre-leucemiche E/R+ e il crosstalk con il microambiente midollare. Il modello è stato ottenuto co-coltivando la linea cellulare proB murina Ba/F3 esprimente E/R e cellule Ba/F3 controllo (in un rapporto di 80:20) con cellule stromali mesenchimali isolate da midollo (BM-MSC). Le condizioni infiammatorie sono state riprodotte stimolando il modello con citochine pro-infiammatorie IL6/IL1β/TNFα. In seguito a stimolazione, abbiamo osservato che le BM-MSC attraggono fortemente le cellule Ba/F3 E/R+ tramite l’asse CXCL1-CXCR2. In aggiunta, nel modello di nicchia midollare infiammata, abbiamo osservato un aumento del danno al DNA sia nelle cellule controllo che nelle cellule E/R+, ma mentre le prime vanno incontro ad apoptosi, le seconde sopravvivono e possono così subire una trasformazione tumorale. (Beneforti L, et al. 2020). Per confermare i risultati ottenuti in vitro, ci siamo avvalsi di un modello di topo transgenico Sca1- E/R. Questi topi spostati da uno stabulario definito specific-pathogen-free (SPF) a uno convenzionale (CF) sviluppano la B-ALL a bassa penetranza, simulando così la condizione umana. Al fine di studiare l’impatto dell’infezione a breve e lungo termine sul compartimento ematopoietico progenitore (Lin-Sca1+c-Kit+ (LSK)) e staminale (LSK CD48-CD150+) abbiamo determinato la loro frequenza nel midollo osseo (BM) dei topi stabulati per 4 e 12 settimane nella CF. In seguito a spostamento dei topi nella CF, abbiamo osservato che mentre l’esposizione a breve termine non influenza il numero delle cellule progenitrici e staminali, l’esposizione a lungo termine porta a una forte espansione del solo compartimento staminale, esclusivamente nei topi Sca1-E/R. Tale espansione era preceduta da un aumento di cellule progenitrici E/R+ nel sangue periferico (PB) con un picco tra 4 e 8 settimane di stabulazione nella CF. Le cellule mobilizzate avevano anche livelli di ROS maggiori rispetto al BM, specialmente quelle pre-leucemiche, che possono renderle più suscettibili a sviluppare altre mutazioni. Inoltre, le cellule E/R+ hanno mostrato una risposta chemiotattica ridotta verso CXCL12, chemochina importante nella ritenzione delle cellule immature nel BM. Infine, è stato valutato il profilo citochinico del BM e PB dei topi stabulati nella SPF e nella CF. Tra le 32 citochine analizzate, abbiamo osservato l’up-regolazione di IL9, G-CSF e IL1 nel siero dei topi WT stabulati nella CF rispetto ai topi Sca1-E/R, mentre nel BM non è stata riscontrata alcuna differenza. I risultati ottenuti sia in vitro che in vivo mostrano come l’infezione/infiammazione possa produrre dei cambiamenti nelle cellule pre-leucemiche E/R e renderle più attive e più prone all’acquisizione di ulteriori lesioni genetiche, ma ulteriori studi, specialmente con il modello in vivo, saranno necessari per comprendere il ruolo dell’infezione/infiammazione nel mantenimento della fase pre-leucemica e l’eventuale evoluzione maligna.