Role of Ryanodine Receptor type 3 (RyR3) in ischemic stroke

Stroke is a leading cause of mortality and acquired disability worldwide. The first genome-wide association study in Italian ischemic stroke patients found a significant association with the missense single nucleotide polymorphism (SNP) rs4780144 in the ryanodine receptor type 3 (RyR3) gene, which leads to a potential loss of function. Multiple evidences suggested that a reduced function of RyR3 could improve stroke outcome. With this study we aimed at investigating the role of RyR3 in ischemic stroke at functional, genomic, and cellular level. Adipose-derived mesenchymal stem cells (Ad-MSCs) express RyR3 but not the other ryanodine receptors (RyR1 and RyR2). We assessed the effect of the rs4780144 genotype on intracellular calcium homeostasis in Ad-MSC lines. Our results confirmed the reduction of the RyR3 function (reduced release of calcium ions into the cytoplasm) in cells with the mutated alleles, which was statistically significant in homozygous donor. A second cohort of 319 Italian ischemic stroke patients with good clinical outcome was genotyped with Illumina Human-24 720. Genotypes of cases (both first and second cohorts) and controls were imputed using the TOPMed reference panel of human haplotypes. This second GWAS replicated the association with rs4780144 and other SNPs in the RyR3 gene. Finally, ischemic injury induced by oxygen-glucose deprivation (OGD) was evaluated in organotypic brain slices from wild-type and RyR3-knockout mice. RyR3- knockout showed a decreased susceptibility to ischemic damage compared to wild-type slices as indicated by the reduced propidium iodide incorporation and LDH release at 48 and 72 h after OGD. RyR3- knockout slices showed also a reduced swelling after OGD, indicating reduction of cytotoxic edema. However, to date no significant differences were found in gene expression analysis performed on neuronal and oxidative stress related genes. The results of this work confirm that RyR3 may play a role in ischemic stroke. In particular, the inhibition of RyR3 could positively modulate ischemic damage, resulting in a new and promising neuroprotective strategy in patients with acute ischemic stroke. However, further studies are needed to clarify the mechanisms that could possibly underlie the observed neuroprotection.

L'ictus è una delle principali cause di mortalità e disabilità acquisita in tutto il mondo. Il primo studio di associazione genome-wide in pazienti con ictus ischemico italiano ha trovato un'associazione significativa con il polimorfismo missenso a singolo nucleotide (SNP) rs4780144 nel gene del recettore della rianodina di tipo 3 (RyR3), che porta a una potenziale perdita di funzione. Molteplici evidenze hanno suggerito che una ridotta funzione di RyR3 potrebbe migliorare l'esito dell'ictus. Con questo studio abbiamo mirato a indagare il ruolo di RyR3 nell'ictus ischemico a livello funzionale, genomico e cellulare. Le cellule staminali mesenchimali di derivazione adiposa (Ad-MSC) esprimono RyR3 ma non gli altri recettori della rianodina (RyR1 e RyR2). Abbiamo valutato l'effetto del genotipo rs4780144 sull'omeostasi del calcio intracellulare nelle linee Ad-MSC. I nostri risultati hanno confermato la riduzione della funzione RyR3 (ridotto rilascio di ioni calcio nel citoplasma) nelle cellule con alleli mutati, che era statisticamente significativa nel donatore omozigote. Una seconda coorte di 319 pazienti italiani con ictus ischemico con buon esito clinico è stata genotipizzata con Illumina Human-24 720. I genotipi dei casi (sia la prima che la seconda coorte) e i controlli sono stati imputati utilizzando il pannello di riferimento TOPMed degli aplotipi umani. Questo secondo GWAS ha replicato l'associazione con rs4780144 e altri SNP nel gene RyR3. Infine, il danno ischemico indotto dalla deprivazione di ossigeno-glucosio (OGD) è stato valutato in fette di cervello organotipiche da topi wild-type e RyR3-knockout. Il knockout di RyR3 ha mostrato una ridotta suscettibilità al danno ischemico rispetto alle sezioni wild-type come indicato dalla ridotta incorporazione di ioduro di propidio e dal rilascio di LDH a 48 e 72 ore dopo OGD. RyR3- fette knockout hanno mostrato anche un gonfiore ridotto dopo OGD, indicando una riduzione dell'edema citotossico. Tuttavia, ad oggi non sono state trovate differenze significative nell'analisi dell'espressione genica eseguita su geni correlati allo stress ossidativo e neuronale. I risultati di questo lavoro confermano che RyR3 può svolgere un ruolo nell'ictus ischemico. In particolare, l'inibizione di RyR3 potrebbe modulare positivamente il danno ischemico, determinando una nuova e promettente strategia neuroprotettiva nei pazienti con ictus ischemico acuto. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per chiarire i meccanismi che potrebbero eventualmente essere alla base della neuroprotezione osservata.