Sox2-dependent molecular functions in the transcriptional controlof glioma and normal neural stem cells

Cancer Stem Cells (CSCs) are a tumor cell sub-population with stem-cell features, i.e. self- renewal (ability to re-form a tumor of the same type) and the ability to “differentiate” into cells constituting the tumor bulk. These hallmarks make them responsible for events such as tumor relapse, metastasis and drug resistance. For this reason it is very important to understand which are the «factors» fundamental for their maintenance. Interestingly, the same transcription factors may be responsible of the maintenance of both normal stem cells and cancer stem cells. In particular we know that the “stemness” transcription factor Sox2, a major regulator in neural stem cells, is also overexpressed in brain tumors. In gliomas, Sox2 is essential to maintain CSC. In mouse high-grade glioma pHGG, Sox2 deletion causes cell proliferation arrest and inability to reform tumors in vivo; 134 genes are significantly derepressed. To identify genes mediating the effects of Sox2 deletion, I overexpressed into pHGG cells nine among the most derepressed genes, and identified four genes, Cdkn2b, Ebf1, Zfp423 and Hey2, that strongly reduced cell proliferation in vitro and brain tumorigenesis in vivo. By CRISPR/Cas9 mutagenesis, or pharmacological inactivation, of each of these genes, individually, I showed that their activity is essential for the proliferation arrest caused by Sox2 deletion. These Sox2-inhibited antioncogenes also inhibited clonogenicity in primary human glioblastoma-derived cancer stem-like cell lines. These experiments identify critical anti-oncogenic factors whose inhibition by Sox2 is involved in CSC maintenance, defining new potential therapeutic targets for gliomas (Barone et al, Glia, under revision; Barone et al, 2018). Further to this work, constituting the main part of my thesis work, I contributed to understand Sox2 function in normal, brain-derived neural stem cells. Here, genome-wide studies (ChIA- PET; ChIPseq; RNAseq) led us to understand that Sox2 acts in gene regulation, at the genome- wide level, by maintaining and regulating a genome-wide network of long-range interactions in chromatin, connecting gene promoters to distant enhancers (Bertolini et al, 2019). This new perspective on Sox2 molecular function allowed us to identify novel Sox2-regulated genes, by identifying SOX2 binding to distant enhancers (ChIPseq), enabling us to understand which gene these enhancers control, through our long-range interaction maps (ChIA-PET and RNAseq data). This led us to identify important new downstream mediators of Sox2 function in neural stem cell self-renewal (Pagin et al, under revision).

Le cellule staminali tumorali (CSC) sono una sottopopolazione di cellule tumorali con caratteristiche di cellule staminali, ovvero autorinnovamento (capacità di riformare un tumore dello stesso tipo) e capacità di "differenziarsi" in cellule che costituiscono la massa tumorale. Questi segni distintivi li rendono responsabili di eventi come recidiva del tumore, metastasi e resistenza ai farmaci. Per questo è molto importante capire quali sono i «fattori» fondamentali per il loro mantenimento. È interessante notare che gli stessi fattori di trascrizione possono essere responsabili del mantenimento sia delle cellule staminali normali che delle cellule staminali tumorali. In particolare sappiamo che il fattore di trascrizione "staminale" Sox2, un importante regolatore delle cellule staminali neurali, è sovraespresso anche nei tumori cerebrali. Nei gliomi, Sox2 è essenziale per mantenere CSC. Nel glioma di alto grado di topo (pHGG), la delezione di Sox2 causa l'arresto della proliferazione cellulare e l'incapacità di riformare i tumori in vivo; 134 geni sono significativamente derepressi. Per identificare i geni che mediano gli effetti della delezione di Sox2, ho overespresso nelle cellule pHGG nove tra i geni più upregolati e ho identificato quattro geni, Cdkn2b, Ebf1, Zfp423 e Hey2, che hanno ridotto fortemente la proliferazione cellulare in vitro e la tumorigenesi cerebrale in vivo. Mediante la mutagenesi CRISPR / Cas9, o inibizione farmacologica, di ciascuno di questi geni, individualmente, ho dimostrato che la loro attività è essenziale per l'arresto della proliferazione causato dalla delezione di Sox2. Questi antioncogeni inibiti da Sox2 hanno anche inibito la clonogenicità in linee di cellule staminali tumorali primarie derivate dal glioblastoma umano. Questi esperimenti identificano fattori anti-oncogenici critici la cui inibizione da parte di Sox2 è coinvolta nel mantenimento della CSC, definendo nuovi potenziali bersagli terapeutici per i gliomi. (Barone et al., 2020; Barone et al., 2018) Oltre a questo lavoro, che costituisce la parte principale del mio lavoro di tesi, ho contribuito a comprendere la funzione di Sox2 nelle cellule staminali neurali normali derivate dal cervello. Qui, studi genome-wide (ChIA-PET; ChIPseq; RNAseq) ci hanno portato a capire che Sox2 agisce nella regolazione genica, a livello genome-wide, mantenendo e regolando una rete genome-wide di interazioni a lungo raggio nella cromatina, collegare promotori genici a stimolatori distanti (Bertolini et al, 2019). Questa nuova prospettiva sulla funzione molecolare di Sox2 ci ha permesso di identificare nuovi geni regolati da Sox2, identificando il legame di SOX2 con esaltatori distanti (ChIPseq), permettendoci di capire quale gene controllano questi potenziatori, attraverso le nostre mappe di interazione a lungo Dati RNAseq). Questo ci ha portato a identificare nuovi importanti mediatori a valle della funzione Sox2 nell'auto-rinnovamento delle cellule staminali neurali (Pagin et al, in corso di revisione).