PRECLINICAL MODELING HIGHLIGHTS THE THERAPEUTIC POTENTIAL OF THE ADOPTIVE TRANSPLANT OF GENE CORRECTED T CELLS IN X-LINKED HYPER-IGM IMMUNODEFICIENCY

Background The X-linked hyper-IgM syndrome type I (HIGM1) is caused by inactivating mutations in the CD40 ligand gene (CD40LG) that disrupt the T cell helper function on B cells and macrophages. This disease represents an ideal candidate for a gene correction strategy because preclinical studies of Hematopoietic Stem Cell (HSC) gene therapy have already shown i) evidence of potential efficacy even with few amounts of transduced cells; ii) critical safety issues due to unregulated transgene expression. Since in HIGM1 the genetic defect is not lethal to T cells, we aim to apply our gene editing strategy on autologous T cells that could be used to provide immediate therapeutic benefit to the patients by resolving pre-existing infections prior to a definitive HSPC transplant. Methods To establish which are the therapeutic threshold levels and transplant conditions required to achieve immune reconstitution and functional immunologic restoration with corrected cells, we infused different doses of WT T cells into HIGM1 mice pre-conditioned or not with different lymphodepleting regimens and performed competitive transplants of WT and Cd40lg-/- HSPC in the mouse model. Results While longitudinal blood analyses showed a long-term, stable T cell engraftment in all the conditions, highest engraftment rates were obtained in mice transplanted after chemotherapy treatment with cyclophosphamide (CPA). All the transplanted mice showed a partial rescue of the antigen-specific IgG response after immunization with Keyhole Limpet Hemocyanin (TNP-KLH) but a higher rescue was observed in mice pre-conditioned with CPA. These mice also showed the presence of TNP-KLH specific IgG producing B cells and germinal centers within splenic lymphoid follicles. HIGM1 mice reconstituted with increasing proportions of WT HSPC displayed a dose-dependent rescue of the T cell mediated immune response. In particular we found that 10% of WT HSPC is sufficient to partially restore serologic immunity against different antigens as well as to attenuate infection in HIGM1 mice challenged with Pneumocystis murina. Conclusions Our current efforts are aimed to demonstrate functional restoration of the immune response against Pneumocystis murina infection in HIGM1 mice that received adoptive transfer of WT CD4+ T cells. If successful, our findings will be instrumental to establish the therapeutic potential of a T cell gene correction approach for the treatment of the HIGM1 disease that could act as a bridge therapy to the HSPC-based strategy.

La terapia genica di cellule staminali ematopoietiche (HSC) ha prodotto benefici clinici in diversi pazienti affetti da una varietà di malattie genetiche. Tuttavia, l’uso di vettori che si integrano nel genoma in modo semi-casuale pone il rischio di mutagenesi inserzionale e di una espressione del transgene ectopica/non regolata. Quest’ultimo problema è particolarmente rilevante quando si trattano geni strettamente regolati attivi sulla proliferazione cellulare, come il gene CD40LG, la cui espressione sulle cellule T attivate porta all’attivazione contatto-dipendente delle cellule B, alla loro proliferazione ed allo scambio di classe delle immunoglobuline. Poichè le sue mutazioni causano l’immunodeficienza legata all’X con iper-IgM (HIGM1), il trasferimento genico in HSC è stato proposto come potenziale trattamento per questa sindrome. Anche se piccole quantità di cellule trasdotte hanno ripristinato la funzione immunitaria umorale e cellulare in un modello murino di HIGM1, l’espressione costitutiva di CD40LG in timociti o in cellule T periferiche ha portato a linfoproliferazioni, molte delle quali sono progredite a linfom. Le strategie di riparazione genica che preservano il controllo fisiologico dell’espressione del gene corretto potrebbero quindi rappresentare un approccio più promettente per il trattamento di HIGM1. In questo studio sfruttiamo il meccanismo Homology Directed Repair (HDR) per la correzione in situ della maggior parte delle mutazioni responsabili della sindrome HIGM1 presenti nel gene CD40L, con l’obiettivo di ristabilirne la funzione e il controllo dell’espressione. In particolare sfruttiamo il sistema CRISPR/Cas9 per promuovere l’integrazione sito-specifica di una copia funzionale di parte del gene CD40L a valle del suo promotore endogeno, correggendo così la maggior parte delle mutazioni responsabili della malattia. Dato che il difetto genetico non è deleterio per le cellule T, questo tipo di malattia ci offre l’opportunità unica di sviluppare una terapia genica basata sulla correzione di cellule T autologhe. Al fine di stabilire quali sono le dosi terapeutiche e le condizioni di trapianto necessarie per ottenere la ricostituzione immunitaria e il ripristino delle funzioni immunologiche con cellule corrette, abbiamo infuso diverse dosi di cellule T WT in topi HIGM1 pre-condizionati o meno con diversi regimi linfodepletanti ed eseguito trapianti competitivi di cellule staminali ematopoietiche WT e Cd40lg - / - nel modello animale. Mentre l’ analisi del sangue periferico ha dimostrato la persistenza a lungo termine di cellule T in tutte le condizioni, sono stati ottenuti livelli di attecchimento più elevati nei topi trapiantati dopo il trattamento chemioterapico con ciclofosfamide (CPA). Tutti i topi trapiantati hanno mostrato un parziale ripristino della risposta IgG specifica dopo immunizzazione con TNP-KLH, ma è stato osservato un ripristino più elevato nei topi pre-condizionati con CPA. Questi topi hanno anche mostrato la presenza di centri germinativi nella milza. Topi HIGM1 ricostituiti con dosi crescenti di HSPC WT hanno mostrato un ripristino dose-dipendente della risposta immunitaria T dipendente. In particolare, abbiamo dimostrato che il 10% di HSPC funzionali è sufficiente a ripristinare parzialmente la capacità di produrre anticorpi specifici contro diversi antigeni oltre che ad attenuare l'infezione in topi HIGM1 inoculati con il patogeno Pneumocystis murina. Il nostro obiettivo futuro è quello di dimostrare il ripristino della risposta immunitaria contro l'infezione da pneumocystis murina in topi HIGM1 trapiantati con cellule T CD4 + WT. In caso di successo, i nostri risultati saranno strumentali per stabilire il potenziale terapeutico di un approccio di correzione genica basato sulle cellule T per il trattamento della sindrome HIGM1 che potrebbe fungere da terapia ponte per una terapia definitiva basata sul trapianto di HSPC corrette.