The multitasking role of monocytes in the bone marrow haematopoietic niche: from the drug-resistance to the maintenance of stem cells

Monocytes/macrophages are crucial component of the normal and malignant niche. In fact, they can regulate HSC self-renewal and differentiation and contribute to increase resistance of leukemic cells to chemotherapy. In the first part of the project, we tested the use of a new conditioning regimen in a poor permissive mouse (SCID-beige) to generate an effective xenograft model of human normal and, above all, malignant haematopoiesis. Combining irradiation and Fludarabine, an immunosuppressive drug used in conditioning regimen in clinic, we were able to augment the human engraftment level in SCID-beige mice as compared to irradiation only, probably due to Fludarabine effect on murine leaky lymphocytes. Using this xenograft model, we have observed that when HSC are transplanted in combination with monocytes, there is a massive increment in human haemopoietic engraftment. Moreover, we demonstrated that monocytes increase in vitro CD34+ cell survival and retain CD34+CD38- multipotent stem cells subpopulation, by both contact- and soluble factors-dependent mechanisms. The classical monocyte subset (CD14+CD16-) is primary responsible to maintain HSC survival and prevent their differentiation. In fact, HSC co-cultured with classical monocytes retain their CFC potential and haematopoietic repopulation activity following intravenous injection in NSG mice. Finally, we observed that Notch and COX-2/PGE2 pathways seems to be involved in this crosstalk. In addition, we deeply investigated ASNase effectiveness against AML cells derived from newly diagnosed patients. Firstly, we considered the anti-leukaemic effects on the bulk population and, most importantly, on AML progenitors (clonogenic cells and, especially, CD34+CD38+ CD34+CD38- LSC), showing that they are intrinsically susceptible to ASNase. Secondly, we evaluated the ASNase toxicity against AML in relation with other BM niche cellular components that can regulate the LSC sensitivity to chemotherapy. These cells include mesenchymal stromal cells and monocytes/macrophages that seem to produce respectively ASNS and CTSB, which inactivate ASNase, increasing the resistance to ASNase treatment.

Monociti e macrofagi sono elementi fondamentali all’interno di una nicchia ematopoietica sia fisiologica che patologica. Infatti, tali cellule possono regolare il mantenimento e il differenziamento delle cellule staminali ematopoietiche e contribuire all’aumento della resistenza delle cellule staminali leucemiche in seguito a trattamento chemioterapeutico. Nella prima parte del progetto, abbiamo testato un nuovo regime di condizionamento in un modello murino poco permissivo (Scid-Beige), ricreando un sistema efficace per lo studio dell’ematopoiesi umana fisiologica e patologica. Combinando l’irradiamento con la Fludarabina, un farmaco immunosoppressivo normalmente utilizzato come sistema di condizionamento in clinica, siamo stati in grado di aumentare l’attecchimento delle cellule umane in topi SCID-beige rispetto al medesimo modello murino condizionato con solo irradiamento. Probabilmente, tale effetto è dovuto alla capacità della Fludarabina di ridurre l’attività immunitaria dei linfociti. Attraverso l’utilizzo di questo modello murino, è stato possibile osservare come, la presenza di monociti, possa aumentare notevolmente l’attecchimento delle cellule staminali ematopoietiche. Infatti, i monociti, in vitro, aumentano la sopravvivenza delle cellule CD34+ e permettono il mantenimento della sottopopolazione CD34+CD38-, sia tramite contatto diretto che attraverso il rilascio di fattori solubili. I monociti classici (CD14+CD16-) sembrano essere i principali responsabili di questo effetto: la presenza di monociti classici in co-coltura con CD34+ permette il mantenimento dello stato indifferenziato e garantisce un corretto attecchimento delle cellule staminali umana in topi NSG. Inoltre, sono stati valutati anche possibili meccanismi d’azione (Notch e COX-2/PGE2) che possono essere implicati in tale processo di mantenimento. In aggiunta, nel presente progetto di tesi, è stata ampiamente investigata l’efficacia del farmaco Asparaginasi (ASNase) nel trattamento di leucemie mieloidi acute (LMA) utilizzando materiale da pazienti alla diagnosi. In primo luogo, è stato considerato l’effetto antileucemico di tale farmaco nei blasti LMA e in particolare nella sottopopolazione dei progenitori (CD34+CD38+ CD34+CD38-), dimostrando che sono intrinsecamente suscettibili al farmaco. Successivamente, abbiamo valutato la tossicità di tale farmaco contro le cellule LMA in relazione ad altri componenti cellulari che possono regolare la sensibilità delle cellule staminali leucemiche al trattamento chemioterapico. Tali cellule includono le mesenchimali stromali e i monociti/macrofagi che sembrano produrre rispettivamente asparaginasi (ASNS) e catepsina B (CTSB), quest’ultima in grado di inattivare ASNase, aumentando la resistenza dei blasti a tale trattamento.