DESIGN, SYNTHESIS AND DEVELOPMENT OF GLYCOTOOLS FOR NEUROCHEMISTRY STUDIES

Background. Glycans play crucial roles within the central nervous system (CNS) and their study is essential for a thorough comprehension of neurochemistry, but the scientific knowledge about CNS glycans remains scarce. The aim of this thesis is to provide the glycochemist and glycoanalyst with novel tools for neurochemistry studies, towards the exploration of glycan roles in the CNS. This thesis presents a novel analytical method for brain N-glycans investigation (LSD); the state of the art of an ongoing work for the investigation of N-glycans and N-glycoproteins differentially expressed in brain tissues of different species; an efficient chemical labelling method for (glyco)proteins, successfully applied on Neuroserpin (NS), a pathologically-polymerising CNS N-glycoprotein; and the syntheses of glycosides and glycodendrimers with potential room for neuromedical studies. Methods. LSD comprised brain tissue (bt) chemical lysis, proteome precipitation (i.e., methanol/chloroform), enzymatic deglycosylation (i.e., PNGase F), N-glycans purification, chemical labelling (i.e., reductive amination on terminal N-acetylglucosamine), and LC-MS bioanalysis. The method has been optimised on bt and thoroughly validated (i.e., sensitivity, precision, linearity, range, selectivity, robustness). N-glycans analysis has also been carried out through protein electrophoresis in-gel deglycosylation, while in-gel trypsinisation was used for the LC-MS identification of N-glycoproteins and N-glycosylation sites. NS has been dimethylated (i.e., reductive amination on lysine) in its monomeric (mhNS) and polymeric (phNS) forms, and the reaction outcome has been evaluated using MS, towards the investigation of NS polymerisation-driving molecular features. Glycosides were synthesised with a Fischer- type glycosylation reaction on unprotected monosaccharides using either allyl alcohol or decenol as glycosyl acceptors, while glycodendrimers were obtained decorating olefin-metathesis-synthesised dendrimers with maltose moieties, exploiting oxime chemistry. Results. LSD displayed the lowest detection limit (1 mg of bt) in comparison to many other works reported in the literature and is the most thoroughly validated neuro-N-glycomic method reported to date. In-gel deglycosylation for brain N-glycans analysis furnished informative chromatograms for every proteome fraction with high resolution (e.g., sensitivity up to 100 EU from a single gel band), permitting the analysis of deglycosylated peptides from the same sample (i.e., a total of 1200 peptides, 570 proteins, 57 N-glycoproteins, and novel N-glycosylation sites identified). NS chemical labelling displayed high efficiency (i.e., 80-90% yield), compatibility with the protein folding, and suitability towards the intended purpose, being able to highlight statistically significant differences in mhNS and phNS labelling patterns (i.e., 9 lysines). The syntheses of glycosides furnished products with good yield (i.e., 70%) and a- stereoselectivity, while that of glycodendrimers afforded molecules exposing several maltose moieties, employable in the context of neurochemistry studies. Conclusions. Methods and molecules delivered within this thesis will benefit the glycochemistry community, by enlarging the glycochemist and glycoanalyst toolkits to carry on the investigation of glycans- related effects in neurological and neuromedical context.

Contesto scientifico. I glicani rivestono un ruolo cruciale nel sistema nervoso centrale (SNC) e il loro studio è fondamentale per un'accurata comprensione della neurochimica, ma la conoscenza scientifica riguardo ai glicani presenti nel SNC è ancora limitata. Lo scopo di questa tesi è fornire nuovi strumenti al glicochimico e al glicoanalista per condurre studi di neurochimica, funzionali all'esplorazione del ruolo dei glicani nel SNC. Questa tesi presenta un nuovo metodo analitico per lo studio degli N-glicani da tessuti cerebrali (LSD); lo stato dell'arte di un lavoro in corso riguardante l'investigazione di N-glicani e N-glicoproteine differentemente espresse in tessuti cerebrali appartenenti a diverse specie; un efficiente metodo di marcatura chimica per (glico)proteine, applicato con successo a una N-glicoproteina, Neuroserpina (NS), che polimerizza nel SNC con conseguenze patologiche; e le sintesi di glicosidi e glicodendrimeri con potenziali applicazioni in studi neurochimici. Metodi. LSD si sviluppa a partire dalla lisi chimica di tessuti cerebrali (tc), con conseguente precipitazione del proteoma (i.e., metanolo/cloroformio), deglicosilazione enzimatica (i.e., PNGase F), purificazione degli N-glicani, marcatura chimica (i.e., amminazione riduttiva su N-acetilglucosammina terminale) e analisi tramite approcci LC-MS. LSD è stato ottimizzato su campioni di tc e accuratamente validato (i.e., sensibilità, precisione, linearità, range dinamico, selettività, robustezza). L'analisi degli N-glicani è stata anche effettuata tramite deglicosilazione enzimatica in-gel da elettroforesi di proteine, mentre un protocollo di digestione con Tripsina in-gel è stato usato per l'identificazione di N-glicoproteine e siti di N-glicosilazione tramite approcci LC-MS su peptidi. NS è stata dimetilata chimicamente (i.e., amminazione riduttiva su lisina), nella sua forma monomerica (mhNS) e polimerica (phNS) e l'esito della reazione è stato valutato tramite MS, per l'investigazione dei determinanti molecolari coinvolti nel meccanismo di polimerizzazione. I glicosidi sono stati sintetizzati usando una reazione di glicosilazione di tipo Fischer, condotta su monosaccaridi deprotetti, usando alcol allilico e decenolo come accettori glicosidici, mentre i glicodendrimeri sono stati ottenuti sfruttando la chimica delle ossime per la decorazione con gruppi maltosilici di dendrimeri sintetizzati tramite metatesi delle olefine. Risultati. LSD presenta il più basso limite di rivelabilità (1 mg di tc) rispetto a molti altri lavori riportati in letteratura ed è attualmente il metodo di neuro-N-glicomica più accuratamente validato. La deglicosilazione in-gel per l'analisi degli N-glicani cerebrali ha prodotto cromatogrammi informativi per ogni frazione del proteoma con elevata risoluzione (e.g., sensibilità fino a 100 EU da una singola banda di gel), permettendo l'analisi dei peptidi deglicosilati dallo stesso campione (i.e., un totale di 1200 peptidi, 570 proteine, 57 N-glicoproteine, e nuovi siti di N-glicosilazione identificati). La marcatura chimica di NS si è dimostrata efficiente (i.e., 80-90% di resa), compatibile con la struttura nativa della proteina, e funzionale all'uso designato, in quanto capace di evidenziare differenze statisticamente significative nel profilo di marcatura di mhNS e phNS (i.e., 9 lisine). La sintesi di glicosidi ha fornito prodotti con buona resa (e.g., 70%) e alfa-stereoselettività, mentre quella dei glicodendrimeri ha generato molecole esponenti gruppi maltosilici, utilizzabili nel contesto di studi di neurochimica. Conclusioni. I metodi e le molecole contenuti in questa tesi apporteranno beneficio alla comunità scientifica glicochimica, incrementando il numero di strumenti che il glicochimico e il glicoanalista possono utilizzare per portare avanti lo studio degli effetti dei glicani in contesto neurologico e neuromedico.