Multifunctional Liposomes modulate Purinergic Receptor-induced Calcium Wave in Cerebral Microvascular Endothelial Cells and Astrocytes

Our previous results show that multifunctional liposomes (mApoE-PA-LIP) reduce brain Aβ burden and ameliorate memory impairment in Alzheimer’s disease (AD) mouse models (Balducci et al., 2014). In light of these results, we assessed liposomes functionalized with ApoE-derived peptide (mApoE) and phosphatidic acid (PA) at neurovascular unit. In particular, we evaluated their activities on cultured human cerebral microvascular cells (hCMEC/D3), as an in vitro human blood brain barrier model, and on cultured astrocytes (iAstro-WT). By means of calcium imaging measurements, we aimed to study the intracellular calcium dynamics triggered by purinergic receptors activation. Our result show that the interaction of mApoE-PA-LIP with the hCMEC/D3 and astrocytes actively induced a modulation in the calcium waves duration of ATP evoked response. In particular, we find an increase of the duration of the ATP evoked calcium waves in presence of mApoE-PA-LIP in comparison to untreated cells. After the mApoE-PA-LIP pre-treatment also the area under the curve (AUC) is increased in comparison to controls both in hCMEC and iAstro-WT. Furthermore, we found that the pre-treatment with mApoE-PA-LIP in absence of extracellular calcium significantly increased ATP evoked calcium waves in comparison to controls. Also under this condition, the AUC increased in comparison to control. We also found that when the Sarco-Endoplasmic Reticulum Calcium ATPase (SERCA) was inactive, due to its specific blockage with cyclopiazonic acid, both in presence or in absence of extracellular calcium, ATP failed to activate calcium wave also after a pre-treatment with mApoE-PA-LIP both in hCMEC and iAstro-WT. In conclusion, mApoE-PA-LIP modulate calcium dynamics evoked by ATP when SERCA is active. In light of the protective role of the purinergic receptor activation (Weisman et al., 2012), our obtained results would provide an additional support to promote mApoE-PA-LIP as putative therapeutic tool for AD treatment.

I nostri precedenti studi dimostrano che liposomi multifunzionalizzati con il monomero dell’ApoE e con acido fosfatidico (mApoE-PA-LIP) riducono l’accumulo di Aβ nel cervello migliorando il declino cognitivo in modelli murini di malattia di Alzheimer (AD) (Balducci et al., 2014). In riferimento ai nostri precedenti risultati, abbiamo studiato l’interazione di liposomi funzionalizzati con un peptide derivante dall’ApoE (mApoE) e acido fosfatidico (PA), con le cellule che costituiscono l’unità neurovascolare. In particolar modo, abbiamo valutato la loro attività in cellule di microcircolo cerebrale umano (hCMEC/D3), utilizzate come modello in vitro di barriera ematoencefalica, e in astrociti in coltura (iAstro-WT). Grazie a misurazioni effettuate con la tecnica del calcium imaging abbiamo studiato le dinamiche di calcio intracellulare generate dall’attivazione dei recettori purinergici. I nostri risultati mostrano che l’interazione dei mApoE-PA-LIP con le hCMEC/D3 e gli astrociti inducono attivamente una modulazione della durata delle onde di calcio indotte dall’attivazione dei recettori purinergici stimolati da ATP. In particolare, possiamo confermare che il pre-trattamento con i mApoE-PA-LIP induce un aumento significativo della durata della risposta indotta dall’ATP che non si verifica nelle cellule controllo. Dopo il pre-trattamento con mApoE-PA_LIP, anche l’area sotto la curva (AUC) risulta essere maggiore rispetto alle cellule non pre-trattate sia nelle hCMEC che negli iAstro-WT. Possiamo inoltre affermare che il pre-trattamento con i mApoE-PA-LIP in assenza di calcio extracellulare, aumenta in modo significativo sia i valori di durata di risposta al calcio allo stimolo di ATP sia quelli di AUC paragonati ai controlli. In aggiunta, abbiamo trovato che quando la pompa del calcio del reticolo sarcoplasmatico (SERCA) è inattiva, perché selettivamente bloccata dall’acido ciclopiazonico, in presenza o assenza di calcio extracellulare, l’ATP non riesce a generare onde di calcio anche dopo pre-trattamento con i mApoE-PA-LIP. In conclusione, considerando il ruolo neuroprottettivo dell’attivazione dei recettori purinergici (Weisman et al., 2012), possiamo affermare che i mApoE-PA-LIP modulano le dinamiche al calcio ATP indotte quando la SERCA è attiva. I nostri risultati potrebbero aggiungere dati interessanti utili a promuovere i mApoE-PA-LIP come innovativo strumento per il trattamento della malattia di Alzheimer.