Reactivity and photochemistry of the active site of FeFe hydrogenase

FeFe hydrogenases are metalloenzymes that catalyze the oxidation and production of H2. The catalytic cycle and many aspects of the reactivity of these enzymes, including their aerobic and anaerobic inactivation, are still the subjects of intense investigations. Spectroscopy is commonly used to obtain information on the electronic structure of the active site of FeFe hydrogenases, by determining the absorption of the enzyme at different wavelengths. In contrast, in this thesis, I propose to use in this context a new technique which we have called "direct photoelectrochemistry", whereby the enzyme is directly wired to an electrode which can be irradiated with a light source, and the turnover frequency is measured as a current. We can detect the absorption of the active site as a function of light wavelength and power by monitoring changes in reactivity upon irradiation. Focusing on the variations of turnover rate, we are sure that we are studying the effect of light on catalytic intermediates. I used direct photo-electrochemistry to study the effect of monochromatic irradiation in the visible range on the kinetics of inhibition by CO of three distinct FeFe hydrogenases. I determined the action spectrum of the photo-dissociation of the inhibitor CO and I described the process at the QM level for the first time, obtaining good agreement between experiments and theory. I also studied the photoinhibition of the enzyme. I carried out photoelectrochemistry experiments irradiating the protein with monochromatic visible light laser diodes, a halogen lamp or a xenon lamp, and I observed that the FeFe hydrogenases from C. reinhardtii and C. acetobutylicum are irreversibly inactivated by UVB light. Using DFT and TDDFT, I concluded that the initial steps of photoinhibition consist in the photodissociation of one carbonyl intrinsic ligand of the active site, followed by the formation of a stable inactive species. I also performed preliminary experiments to examine the effect of light on the activity of two other metalloenzymes: Carbon monoxide dehydrogenase (CODH) and NiFe-hydrogenase. I observed that the turnover rate of CODH is not affected by light, but the reactivation of the enzyme after exposure to oxygen is faster upon irradiation with white light. I also showed that the oxidized, inactive form of NiFe-hydrogenase reactivates more quickly upon irradiation with violet/blue light than in the dark. My results illustrate the strength of the methodological approach that combines direct electrochemistry and TDDFT, and reveal new insights in the chemical and photochemical properties of several metalloenzymes.

Le FeFe idrogenasi sono metalloenzimi che catalizzano l’ossidazione e la produzione di H2. Il ciclo catalitico e vari aspetti di questi enzimi, come l’inattivazione in condizioni aerobiche e anaerobiche, sono tutt’ora oggetto di studio. Per ottenere informazioni sulla struttura elettronica del sito attivo delle FeFe idrogenasi vengono abitualmente impiegate tecniche spettroscopiche, grazie alle quali viene determinato l’assorbimento di luce a diverse lunghezze d’onda da parte dell’enzima. In questa tesi, invece, abbiamo sviluppato una nuova tecnica, detta “fotoelettrochimica diretta”, in cui l’enzima è direttamente collegato ad un elettrodo, che può essere illuminato da una sorgente luminosa, e la frequenza di turnover viene direttamente misurata sotto forma di corrente elettrica. Monitorando le variazioni dell’attività dell’enzima in presenza di irraggiamento, possiamo determinare l’assorbimento del sito attivo in funzione della lunghezza d’onda e della potenza della sorgente luminosa. Concentrandoci sulle variazioni della frequenza di turnover, siamo certi che stiamo indagando l’effetto della luce localizzato sul sito attivo. Abbiamo utilizzato la fotoelettrochimica diretta per studiare l’effetto dell'irraggiamento, per mezzo di laser monocromatici, sulla cinetica di inibizione da CO in tre distinte FeFe idrogenasi. Abbiamo determinato lo spettro d’azione della fotodissociazione del CO inibitore e abbiamo descritto il processo a livello QM per la prima volta, ottenendo un buon accordo tra dati sperimentali e teorici. Ci siamo poi focalizzati sullo studio della fotoinibizione dell’enzima. Tramite esperimenti di fotoelettrochimica, in cui la proteina è stata illuminata per mezzo di laser monocromatici, una lampada alogena o una lampada allo xeno, abbiamo determinato che le FeFe idrogenasi di C. reinhardtii e C. acetobutylicum sono inattivate irreversibilmente dai raggi UVB. Utilizzando DFT e TDDFT, abbiamo concluso che le fasi iniziali della fotoinibizione consistono nella fotodissociazione di uno dei carbonili intrinsecamente legati al sito attivo, seguita dalla formazione di specie stabili inattive. Infine, abbiamo condotti esperimenti preliminari per esaminare l’effetto della luce sull’attività di altri due metalloenzimi: la monossido di carbonio deidrogenasi (CODH) e la NiFe idrogenasi. L’attività catalitica della CODH non viene alterata dall’illuminazione, mentre la riattivazione dell’enzima, in seguito ad esposizione all’ossigeno, è più rapida in presenza di illuminazione con una lampada allo xeno. Inoltre, la NiFe idrogenasi, in una forma inattiva, si riattiva più rapidamente in presenza di irraggiamento con un laser violetto/blu che al buio. I risultati dimostrano la solidità di questo approccio metodologico, che combina elettrochimica diretta e TDDFT, e forniscono nuove informazioni sulle proprietà chimiche e fotochimiche di vari metalloenzimi.