The RNA processing proteins Xrn1 and Rrp6 regulate DNA damage checkpoint activation and telomere metabolism

Genome instability is one of the most pervasive characteristics of cancer cells. It can be due to DNA repair defects, failure to arrest the cell cycle and loss of telomere-end protection that lead to end-to-end fusion and degradation. Among the many types of DNA damage, the DNA Double Strand Break (DSB) is one of the most severe, because it can cause mutations and chromosomal rearrangements. Eukaryotic cells respond to DSBs by activating a checkpoint that depends on the protein kinases Tel1/ATM and Mec1/ATR, in order to arrest the cell cycle until DSBs are repaired. Mec1/ATR is activated by RPA-coated single-stranded DNA (ssDNA) that arises upon nucleolytic degradation (resection) of the DSB. A similar checkpoint response is triggered when the natural ends of eukaryotic chromosomes lose their protection, resembling and being recognized as DSBs. This protection is provided by specialized nucleoprotein complexes called telomeres. Telomeric DNA consists of repetitive G-rich sequences that terminate with a 3’-ended single-stranded overhang (G-tail), which is important for telomere extension by telomerase. Several proteins, including the CST complex, are necessary to maintain telomere structure and length in both yeast and mammals. Emerging evidences indicate that RNA processing proteins play critical, yet poorly understood, roles in genomic stability and telomere metabolism. We provide evidence that the Saccharomyces cerevisiae RNA decay factors Xrn1, Rrp6 and Trf4 facilitate activation of Mec1/ATR by promoting the generation of RPA-coated ssDNA at intrachromosomal DSBs. Xrn1 and Rrp6 are also required to activate a Mec1/ATR-dependent checkpoint at uncapped telomeres due to loss of the CST component Cdc13. Xrn1 promotes checkpoint activation by facilitating the generation of ssDNA at both DSBs and uncapped telomeres. Xrn1 exerts this function at DSBs by promoting the loading of the MRX complex, whereas how it does at uncapped telomeres remains to be determined. By contrast, DSB resection is not affected by the absence of Rrp6 or Trf4, but their lack impairs the recruitment of RPA, and therefore of Mec1, to the DSB. Rrp6 and Trf4 inactivation affects neither Rad51/Rad52 association nor DSB repair by homologous recombination (HR), suggesting that full Mec1 activation requires higher amount of RPA-coated ssDNA than HR-mediated repair. Finally, we demonstrate that Xrn1 maintains telomere length by promoting the association of Cdc13 to telomeres independently of ssDNA generation and exerts this function by downregulating the RIF1 transcript. Our results provide novel links between RNA processing and genome stability.

L’instabilità genomica è una delle caratteristiche principali delle cellule tumorali e può essere causata da difetti nella riparazione del DNA, dal mancato arresto del ciclo cellulare e dalla perdita della protezione telomerica all’estremità dei cromosomi, che porta alla degradazione e alla fusione delle estremità. Tra i vari tipi di danno al DNA, le rotture della doppia elica del DNA (Double-Strand Break o DSB) rappresentano una delle lesioni più pericolose, poiché possono causare mutazioni o riarrangiamenti cromosomici. In presenza di DSBs, le cellule eucariotiche attivano un checkpoint, dipendente dalle protein chinasi Tel1/ATM e Mec1/ATR, che arresta il ciclo cellulare finché il danno non è stato riparato. Mec1/ATR è attivata dal DNA a singolo filamento (ssDNA) ricoperto da RPA che si forma dopo il processamento nucleolitico (resection) delle estremità del DSB. Una simile risposta è attivata anche quando le estremità naturali dei cromosomi eucariotici perdono la loro protezione, generando delle estremità simili ad un DSB che vengono riconosciute dal checkpoint e dai meccanismi di riparazione. Questa protezione è fornita da complessi nucleoproteici specializzati, chiamati telomeri. Il DNA telomerico è costituito da sequenze ripetute ricche in G che terminano con una coda a singolo filamento sporgente in 3’ (detta coda G), la quale è importante per l’estensione dei telomeri ad opera della telomerasi. Diverse proteine, tra cui il complesso CST, sono necessarie al mantenimento della struttura e della lunghezza dei telomeri sia in lievito che nei mammiferi. Recenti dati sperimentali indicano che i fattori che processano l’RNA hanno un ruolo fondamentale nella stabilità del genoma e nel metabolismo telomerico, anche se il meccanismo è ancora poco compreso. In questa tesi abbiamo dimostrato che in Saccharomyces cerevisiae le proteine che degradano l’RNA Xrn1, Rrp6 e Trf4 promuovono l’attivazione di Mec1/ATR facilitando la formazione di DNA a singolo filamento ricoperto da RPA ai DSB. Inoltre, Xrn1 e Rrp6 sono necessarie per attivare il checkpoint anche ai telomeri deprotetti a causa del malfunzionamento di Cdc13, una delle subunità del complesso CST coinvolto nella protezione dei telomeri. Xrn1 facilita la formazione di DNA a singolo filamento ai DSBs promuovendo il caricamento del complesso MRX, mentre come svolga questa funzione ai telomeri deprotetti rimane ancora da chiarire. Al contrario, la generazione di ssDNA ai DSBs non è influenzata dalla mancanza di Rrp6 o Trf4, ma la loro assenza ostacola il reclutamento di RPA e quindi di Mec1 al sito di danno. L’inattivazione di Rrp6 e Trf4 non influenza né l’associazione di Rad51/Rad52 ai DSB né la riparazione della rottura attraverso la ricombinazione omologa (Homologous Recombination o HR), suggerendo che la piena attivazione di Mec1 richieda più DNA a singolo filamento ricoperto da RPA di quanto ne sia richiesto per la riparazione attraverso la ricombinazione omologa. Infine, Xrn1, regolando negativamente il trascritto di RIF1, è coinvolto nel mantenimento della lunghezza dei telomeri promuovendo l’associazione di Cdc13 indipendentemente dalla formazione di DNA a singolo filamento. In conclusione, i nostri risultati forniscono un nuovo collegamento tra il processamento dell’RNA e il mantenimento della stabilità del genoma.